[摘 要]通过对猪和鸡组织样品中的克仑特罗、链霉素等兽药的检测,比较了蛋白芯片检测试剂盒、EL ISA检测试剂盒和确证方法在兽药残留检测中的应用。结果表明:蛋白芯片检测试剂盒与EL ISA试剂盒性能相当,与确证方法的结果有很好的一致性,且具有同时检测多种兽药,前处理方法简单、速度快等优点。
[关键词]生物芯片;蛋白芯片;多残留检测;样品检测
蛋白芯片兽药残留检测试剂盒集成了样品前处理及样品检测过程,该项技术是二十一世纪发展起来的一种新的食品中兽药残留量检测技术。目前,该试剂盒可以实现对猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝4种组织以及猪尿中恩诺沙星、磺胺二甲嘧啶、链霉素、克仑特罗的半定量检测,除具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单,检测方便快速等优点外,还可实现对上述多种兽药同时并行检测的优点,极大地节省了检测费用,缩短了检测时间,进而提高了检测效率。笔者利用蛋白芯片兽药残留检测试剂盒对动物组织中几种常用兽药的残留进行了检测,并与其它方法进行了比较。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 仪器与设备
芯片扫描仪,晶芯mEcoScan-100,北京博奥生物芯片有限公司; 均质器, JZ-Ⅱ型,中国铁道部电化院四方电器设备厂;旋转蒸发仪, RE252AA型, 上海亚荣生化仪器厂; 离心机,GL-20G-Ⅱ型,上海安亭科学仪器厂;酶标仪,MK3型,芬兰Thermo; 气相色谱2质谱联用仪, TRACEDSQ,菲尼根;液相色谱仪,四元梯度泵配2695紫外检测器和2475荧光检测器,Waters公司;自动快速浓缩,DSY-Ⅱ型,北京金科精华苑技术研究所;多功能微生物自动测量分析仪, ZY2300Ⅳ,北京威锋技术开发公司;恒温培养箱, SGSP202型,黄石市恒丰医疗器械有限公司;旋涡混合器, TDX-1型,通达科技。固相萃取柱: C18 , 100 mg/mL,含碳量≥16 (用于恩诺沙星残留分析) ; SupelcleanLC-C18 Sep pak 500 mg/3 mL 和SCX小柱LC-SCXSep pak 500 mg/3 mL,美国SUPELCO公司(用于GC-MS法分析克仑特罗残留) ;RIDA C18 , 德国拜发公司。
1. 1. 2 EL ISA检测试剂盒
克仑特罗残留检测试剂盒( 05073 ) 和磺胺二甲嘧啶残留检测试剂盒( EN5327) ,德国r2Biopharm公司;蛋白芯片兽药残留检测试剂盒,批号20031202, 20040701,北京博奥生物芯片有限公司。
1. 1. 3 试药与试剂
链霉素标准品,批号0308-200012,效价712单位/mg;盐酸克仑特罗对照品,批号0072-8501,含量99. 6%;磺胺甲噁唑对照品,含量99. 0%;均由中国药品生物制品检定所提供。磺胺二甲嘧啶对照品,批号51K1523,含量99. 0%;磺胺甲氧哒嗪对照品,含量99%;磺胺二甲氧嘧啶对照品,含量99. 9%;磺胺甲氧嘧啶对照品,含量99%;磺胺喹噁啉对照品,含量97. 2%;沙丁胺醇对照品,含量99%;均购自美国Sigma公司。硫酸链霉素及双氢链霉素对照品,含量≥99% , Fluka 公司;环丙沙星对照品,含量≥99% ,B iometical公司。恩诺沙星对照,批号H010102,含量100. 1% ,中国兽医药品监察所提供。甲醇和乙腈,色谱纯, Fisher公司。
1. 1. 4 实验用菌和实验动物
实验菌为枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis) ,菌株号为CMCC63501,由中国兽医药品监察所提供。实验阳性动物为本所自己饲养添加药物的10头猪和29只鸡(见表1) ,停药2 d后屠宰取样;阴性鸡肉由实验动物研究中心提供,阴性猪肉和肝超市采样获得;实验样品部分来自市场和屠宰厂。
1. 2 方法
1. 2. 1 蛋白芯片试剂盒灵敏度评价
1. 2. 1. 1 标准曲线溶液的配制：将各种药物对照品(标准品)按实验所需配制成标准溶液,详见表2。
1. 2. 1. 2 芯片反应：操作方法按兽药残留蛋白芯片检测试剂盒说明书进行。
1. 2. 1. 3 扫描及数据处理：芯片反应完毕后进行图像扫描和数据处理,将校正后的荧光信号强度对各对照品(标准品)溶液药物浓度作标准曲线,并求出每种药物的IC50 (荧光信号强度下降一半的药物浓度)值。
1. 2. 2 蛋白芯片试剂盒特异性评价
1. 2. 2. 1 标准曲线溶液的配制：将各种药物对照品(标准品)按实验所需配制成标准溶液,详见表3、4、5、6。
1. 2. 2. 2 芯片反应：按兽药残留蛋白芯片检测试剂盒说明书进行。
1. 2. 2. 3 扫描及数据处理：芯片反应完毕后进行图像扫描及数据处理,将校正后的荧光信号强度对各对照品(标准品)溶液药物浓度作标准曲线,并求出每种药物的IC50值,再以芯片检测目标药物交叉反应率为100% ,按以下公式计算其它药物(待测药物B如磺胺喹噁啉等)与芯片检测目标药物(参考药物A,如磺胺二甲嘧啶)之间的交叉反应率。
药物B的交叉反应率=参考药物A的IC50/待测药物B的IC50 ×100%
1. 2. 3 样品前处理
1. 2. 3. 1 蛋白芯片试剂盒：称取5. 0 g粉碎后的样品,放入离心管中,加入10. 0 mL组织样品制备液,旋紧管盖,用旋涡混合器剧烈混合2 min, 80 ℃水浴20 min,取出离心管,冷却至室温,以5 000r /min室温离心10 min,然后吸取200μL的上清液转移到1. 5 mL离心管中,加入800μL组织样品稀释液,盖上管盖,充分混合后即可用于检测。
1. 2. 3. 2 磺胺二甲嘧啶残留测定(EL ISA法) ：称取5. 0 g粉碎后的样品与20 mL乙腈水溶液(86 +16)混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min离心10 min,取3 mL上清与3 mL蒸馏水混合,加入4. 5 mL醋酸乙酯混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min离心10 min,将醋酸乙酯层转移至另一瓶中*干燥,用1. 5 mL稀释了的缓冲液溶解残渣,加入1. 5 mL 正己烷混合5 min, 15 ℃以6 000 r/min离心10 min,*除去正己烷相,取50μL水相进行分析。
1. 2. 3. 3 磺胺二甲嘧啶残留测定(HPLC法)按文献[ 1 ]方法进行。
1. 2. 3. 4 链霉素残留测定(微生物学法) [ 4 ]：称取5. 0 g粉碎后的样品,加入20 mL 磷酸缓冲液(pH 1. 5) ,匀浆后离心分离。取上清液用10 mol/L氢氧化钠溶液调pH至8. 5,离心后取其上清液作为样液。
1. 2. 3. 5 克仑特罗残留测定(EL ISA法) ：按试剂盒说明书的方法进行。
1. 2. 3. 6 克仑特罗残留测定( GC2MS法) ：按NY/QY468 - 2001方法进行[ 2 ] 。
1. 2. 3. 7 恩诺沙星残留测定(HPLC法) ：按文献[ 3 ]方法进行。
1. 2. 4 样品测定：蛋白芯片兽药残留检测方法,按兽药残留蛋白芯片检测试剂盒使用说明书进行;EL ISA法测定, 按磺胺二甲基嘧啶、克仑特罗的EL ISA检测试剂盒操作说明进行;磺胺二甲基嘧啶和恩诺沙星残留检测的液相色谱法分别按文献[ 1, 3 ]方法进行;链霉素在动物组织中残留的微生物学检测方法,按文献[ 4 ]进行;猪尿中克伦特罗的(GC2MS)检测方法按文献[ 5 ]进行;动物组织中克仑特罗的测定(GC2MS) ,按参考文献[ 2 ]进行。
2 结果
2. 1 蛋白芯片试剂盒指标测试结果：本实验对用于兽药残留检测的蛋白芯片相关指标进行了初步研究,各项指标测试结果见表7、8。
2. 2 蛋白芯片试剂盒与其他检测方法样品检测结果比较：相同的样品用蛋白芯片试剂盒检测后,再用EL ISA试剂盒、抗生素微生物检定法、HPLC法和GC - MS法等方法进行了测定,依据农业部第235号文件中的兽药zui高残留*[ 6 ]判定样品中的兽药残留是否超标。结果如表9所示。
3 讨论
3. 1 从1. 2. 1中可以看出,用蛋白芯片进行兽药残留检测的样品前处理方法简单、速度快,且用同一种方法提取了多种兽药,减少了样品前处理时间(与其它方法比较情况见表10) 。
3. 2 从表9得出,在对102份样品的检测中,其他方法检测的阳性样品数为38,而蛋白芯片试剂盒检测的阳性样品数为40,两者有很好的符合率。用EL ISA试剂盒共检测了58份样品,其中阳性样品22份,而蛋白芯片试剂盒检测的阳性样品为20份,两者的符合率也较好。以上结果说明蛋白芯片试剂盒结果可靠。
3. 3 与其他方法相比,蛋白芯片试剂盒具有并行处理的能力,在一张芯片上可同时检测2种以上的兽药,目前的蛋白芯片试剂盒可同时检测磺胺二甲基嘧啶、克仑特罗、链霉素和恩诺沙星,可根据需要在一张芯片上检测多种兽药。
4 结论
生物芯片用于兽药残留检测具有可同时检测多种兽药、准确性高、前处理简单、速度快等优点。
目前用于兽药残留检测的生物芯片正处于发展的初期,可检测的兽药种类相对较少,但初步实现了多残留检测,显示出生物芯片的并行性和高通量性,且生物芯片容易实现集成化和自动化,在兽药残留的自动化检测上具有一定的优势。本实验是国内外使用生物芯片对兽药残留进行检测。
